АННОТАЦИЯ

За пределами магнитного поля Земли галактические космические лучи (ГКЛ) являются основной частью радиационного воздействия на человека. Поток постоянен и состоит из частиц высокой энергии от протонов до ионов железа.

В результате своей высокой энергии (миллиарды электрон-вольт), эти частицы создают повреждения биомолекул, например двунитевые разрывы ДНК, что приводит к генетическим мутациям и раковыми заболеваниям. Защитой, что разработала природа для клеток млекопитающих, является прямое соединение разорванной ДНК через негомологичное соединение концов. Этот механизм также называют репарационной (восстановительной) наномашиной НСК ДНК. Он лишь частично успешен в ремонте повреждений ДНК человека. Главной темой данной статьи является рассмотрение модификации этого механизма для улучшения его работы. Цель состоит в том, чтобы увеличить время, что люди могут провести во внеземном пространстве примерно на 2 года.

ВВЕДЕНИЕ

При полётах за пределами магнитного поля Земли, то есть очень высоко, сильно сказываются галактические космические лучи. Они состоят из частиц высокой энергии от протонов до ионов железа. В результате их высокой энергии (ГэВ) эти частицы создают повреждения в биомолекулах, которые могут привести к долгоиграющим изменениям, таким как генетические мутации и развитие рака. Именно эти биологические изменения и определяют основные риски долгосрочных космических полётов.

ХАРАКТЕРИСТИКА ГАЛАКТИЧЕСКОГО КОСМИЧЕСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

Распределение энергий ГКЛ имеет локальный максимум около 2 сотен МэВ на нуклон с последующим снижением в сторону более высоких энергий. Расчёты прохождения ГКЛ в различных защитных материалах, как алюминий, показывают, что после небольшого уменьшения энергии в первых тонких экранирующих слоях, более толстые поглотители не дают то сокращение биологического воздействия, которое можно было бы ожидать от предложенного увеличения массы экранирующего материала. Уменьшение количества низкоэнергетических частиц практически компенсируется увеличением ядерной фрагментации. Для того, чтобы защитить космонавтов от вредных биологических эффектов ГКЛ предлагается разработать другой метод защиты.

ДРУГОЙ ПОДХОД К РАДИАЦИОННОЙ ЗАЩИТЕ — УВЕЛИЧЕНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ПО РЕПАРАЦИИ ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК.

Травмирующее воздействие ГКЛ проявляется в развитии двунитиевых разрывов ДНК (ДР). В клетках млекопитающих первой линией обороны против ДР является прямая связка разрывов ДНК через негомологичное соединение концов. Предлагается разработать научно-исследовательскую программу для укрепления этой «первой линии обороны» и продлить время пребывания людей на Луне или Марсе. Вполне вероятно, что нанотерапия — быстро растущая область медицинских исследований и разработок, будет играть важную роль в этом подходе.

РАДИАЦИОННЫЙ РИСК КОСМИЧЕСКОЙ СРЕДЫ

Человек в космосе подвержен влиянию I) протонов II) тяжёлых ионов с высоким зарядом (Z) и высокой энергией (Е) и вторичному излучению — в основном нейтронному. Распределение ГКЛ по энергиям максимально в районе 1000 МэВ/нуклон, оно настолько проникающее, что экранирование может лишь частично уменьшить получаемую экипажем дозу. Толстые экранирование даст проблемы с запуском системы из-за дополнительной массы и может уменьшить эффективную дозу лишь примерно на 25% при использовании алюминия и примерно на 35% при использовании полиэтилена. Таким образом, за исключением солнечных протонов, экранирование не сможет решить проблемы радиационного облучения в космосе.

Биофизические модели показывают, что линейная передача энергии высокоэнергетического излучения даёт разные поражения ДНК, в том числе и сложные разрывы нитей ДНК. Количество одно- (ОР) и двунитиевых разрывов (ДР) мало изменяется с типом излучения [1]. Но для высокоэнергетического излучения с линейной передачей энергии большая часть поражений ДНК имеет сложный характер, и состоит вместе из ОР и ДР, происходящих в пределах локализованной области ДНК. Ремонт ДР происходит путем прямого присоединения концов и гомологической рекомбинации. Множественные разрывы почти не ремонтируются и, таким образом, приводят к гибели клеток. Риск рака увеличивается. Максимальный допустимый уровень этого риска для космонавтов установлен ​​на уровне 3% (то есть обычный риск смерти от рака).

МЕХАНИЗМ РЕПАРАЦИИ ДНК ЧЕРЕЗ НЕГОМОЛОГИЧНОЕ СОЕДИНЕНИЕ КОНЦОВ (НСК) [2]

В этом механизме сломанные концы сводятся друг к другу и воссоединяются в отсутствие длинных участков гомологичных последовательностей. Этот тип репарации имеет место в организмах, начиная от бактерий до млекопитающих, что указывает, что он сохранялся в процессе эволюции. Общая схема механизма НСК: концы просто сводятся и затем соединяются

Новый точечный рисунок

Проблема, однако, может возникнуть в следующем: если у клетки более одного парного разрыва, то ранее несвязанные ДНК могут соединиться, что приведёт к грубой хромосомной перегруппировке. В клетках млекопитающих, как правило, воссоединяются правильные концы в механизме НСК.

Связывание специальных белковых соединений с разорванными концами является первым шагом в механизме (Рис. 1c). Ключевым шагом является физическое сближение концов ДНК (Рис. 1с). Если сближенные концы ДНК могут быть сразу лигированы то завершение ремонта требует только действия ДНК-лигазы. Тем не менее, большинство ДР случаются под воздействием ДНК-повреждающих агентов, не имеют лигируемых концов и поэтому должны быть обработаны до лигирования. Это предполагает участие ферментов, устраняющих поражения на концах ДР в НСК. После завершения восстановления, как представляется, происходит стадия выравнивания, в которой сравниваются последовательности ДНК на концах, затем разрывы соединяются (Рис. 1d).

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НСК У МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Генетические и биохимические исследования выявили Ku-комплекс, с гетеродимерами Ku70 (69 килодальтон) и Ku86 (83 килодальтона, также известный как Ku80), в качестве основного фактора связывания концов разрыва ДНК в клетках млекопитающих.

Структура Ku в соединении с ДНК показала, что гетеродимер имеет тороидальную форму с центральным отверстием достаточно большим, чтобы вместить спираль ДНК [3]. Внутренняя часть асимметричного кольца выровнена положительно заряженными аминокислотами, допуская взаимодействие, независимое от последовательности, с отрицательно заряженной фосфодиэфирной связью спирали ДНК. Активность Ku на разрыве зависит от инозитол-6-фосфата, который связывается с Ku-комплексом. Возникающей общей темой различных путей восстановления ДНК является роль белково-белковых взаимодействий в создании многобелковых ремонтных комплексов (Рис.2).

Новый точечный рисунок (3)

В силу своей локализации относительно разрыва в начале НСК, ДНК-протеинкиназа хорошо расположена, чтобы привлечь другие факторы восстановления ДНК для помощи в репарации и процессинге. Основные факторы НСК также необходимы для завершения V(D)J-рекомбинации, инициированной продуктами особых эндонуклеазов RAG1/RAG2. После окончания выравнивания и нуклеолитического процессинга ДНК, как правило, остаются небольшие пробелы, которые необходимо заполнить до соединения ДНК. У млекопитающих соединения, называемые полимеразой X (рис. 3е), полимеразой μ и полимеразой λ вовлекаются в это заполнение, связанное с НСК [7,8]. Таким образом, в клетках млекопитающих, первой линией обороны против двунитиевых разрывов является прямое соединение разорванных нитей ДНК через негомологичное соединение концов. Ремонт может также быть выполнен путем гомологической рекомбинации (ГР). Во время ГР гомологичная последовательность (обычно сестринской хроматиды) используется в качестве шаблона для получения генетической информации и восстановления ущерба. В противоположность этому, НСК воссоединяет 2 конца двунитевого разрыва ДНК непосредственно, не требуя гомологичных последовательностей на концах ДНК.

Новый точечный рисунок (2)

Гомологическая рекомбинация также обеспечивает путь, с помощью которого неправильные или поломанные репликативные вилки могут быть восстановлены, таким образом повышая живучесть клеток. Этот способ репарации не будет рассматриваться в данной статье.

 

НАНОМАШИНЫ ПО РЕМОНТУ ДНК – РАБОТА НСК ПО ВОССТАНОВЛЕНИЮ РАЗРЫВОВ

В ядре клетки полно нанометровых структур, связанных с такими функциями, как транскрипция РНК, процессинг РНК, репликация ДНК и репарация ДНК. Эти структуры не заключены в отдельные липидные мембраны и являются самоорганизующимися наномашинами. Восстановление ДНК происходит непрерывно в клетках человека, являясь ответом на повреждение от токсинов окружающей среды и от вырабатываемых организмом окислителей. У человека есть около 150 генов для белков, репарирующих ДНК. Эти белки образуют около 12 видов различных ремонтных наномашин, каждая из которых специализируется на своём повреждении.

Двунитевые разрывы и поддержание целостности генома

Ионизирующее излучение вызывает двунитевые разрывы ДНК, приводящие к мощным биологическим эффектам [9]. Эти разрывы приводят к хромосомным перестройкам, созданию ацентрических фрагментов у хромосом и т.д.

Даже один неотремонтированный разрыв может привести к значительной потере информации в процессе клеточного деления и к гибели клеток [10]. Прохождение ионизирующего излучения высокой энергии через ткани даёт активные химические вещества распределённые неоднородно в нанометровом масштабе около таекторий частиц. Когда траектория пересекает спираль ДНК, обе нити повреждаются одновременно, часто с образованием двунитиевого разрыва. Сразу после определения повреждения начинается репарация с быстрым компонентом, имеющим период полураспада от 7 до 14 минут и затем с медленным компонентом с периодом от 60 до 90 минут [11]. Наномашины двух типов действуют при этом восстановлении. Как уже упоминалось выше, будет рассматриваться только негомологичное соединение концов (НСК), в нём ДНК-лигазы непосредственно воссоединяют разорванные малогомологичные концы ДНК, они часто оставляют небольшой участок изменённой последовательности на месте разрыва [12, 13]. НСК считается основным путём при клинически значимых дозах облучения.

Структурные функции и сборка НСК-наномашин

НСК происходит в пределах субъядерных структур, называемых фокусами репарации, или фокусами, индуцированными ионизирующим излучением. Такие структуры определяются наличием домена модифицированного хроматина, обогащённого фосфорилированным гистоном γ-H2AX, который может быть визуализирован с помощью анти-γ-H2AX антител [14]. Очаги появляются через минуты после облучения и исчезают через 60-90 минут. Количество фокусов приближенно показывает число разрывов, ожидаемых для данной дозы радиации. На рисунке 4 показаны клетки меланомы человека, облучённые 0,1 Греем ионизирующего излучения, что, как ожидается, создаст примерно 3 двойных разрыва на диплоидный человеческий геном в клетке. От трёх до четырёх фокусов наблюдались в этих клетках через 30 минут после облучения. Через 90 минут большинство очагов исчезли.

Новый точечный рисунок (4)

Внутренняя структура репарационных очагов до сих пор неизвестна, но можно заключить некоторые факты на основе генетических, биохимических и цитологических исследований (рис. 4 В и С). По данным иммунофлуоресцентной микроскопии, репарационные фокусы появляются сначала в качестве дифракционно-ограниченных точечных источников, по которым видно, что их максимальный размер составляет менее 250 нм (Рис.4B). Область с хроматином, содержащим γ-H2AX содержит примерно 1 миллион нуклеотидных пар на каждой стороне [14]. Область ДНК такого размера имеет длину около 70 000 нм — в несколько сотен раз больше оценочного максимального диаметра репарационных фокусов. Цитологическая характеристика репарации является одним из подходов к пониманию НСК. Генетические и биохимические исследования дают ещё один подход, сосредотачивающий внимание на роли ферментов и других связывающих ДНК белков. Рисунок 4C показывает сегодняшнее понимание ядра комплекса НСК на основе таких исследований. 2 половинки повреждённой ДНК можно представить в виде двойных спиралей, движущихся с противоположных направлений. Пять генных продуктов прицепляются непосредственно к концам разрывов ДНК и выполняют ферментативную роль в НСК. Ku-белок, гетеродимерные субъединицы в 70 килодальтон (Ku70) и 80 килодальтон (Ku80), прицепляются к концам разрывов ДНК [17], транслируются и приводят ДНК-зависимую протеинкиназную каталитическую субъединицу [18, 19]. Из 5 генных продуктов, которые составляют основу ферментативной машины НСК, только присутствие фосфорилированной формы ДНК-протеинкиназы определялось в репарационных очагах иммунофлуоресценции [20].

Изменение функций ДНК-наномашин для увеличения возможностей восстановления при воздействии высокоэнергетического излучения

Модификация наномашин, задействованных в НСК с тем, чтобы увеличить скорость ремонта была бы одним из способов увеличения времени пребывания космонавтов на Луне и Марсе. Известно, что одноцепочечные антитела (ScFv) могут изменить функции наномашин [21]. Предполагается, что могут существовать такие антитела, которые могут увеличить скорость НСК. Для ScFv 18-2, например, наблюдалось взаимодействие с НСК и фактическое его торможение.

Существует доказательство взаимосвязи транскрипции и репарации двухнитиевых разрывов [22]. Ядерные экстракты из клеток, не имеющих Ku-протеин, например, показывают, характерный дефект в реинициации транскрипции, и мутировавший Ku-белок имеет преимущественно негативное влияние на транскрипцию [22]. Ku могут быть химически на месте присоединены в районах, где происходит удлинение хроматина. Действительно, по неясным причинам, потеря функций Ku-белков у человеческих соматических клеток приводит к быстрой, в течение нескольких дней, потере жизнеспособности клеток. Было высказано предположение, что НСК наномашины могут собираться вблизи или на поверхности «узлов активности хроматина», которые служат в качестве основного источника, где вырабатывается предварительная матричная РНК в клетке. Способность этих узлов связывать хроматин в петли может стабилизировать парные соединения сломанной ДНК, пока собирается ремонтная наномашина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В качестве стратегии увеличения скорости восстановления повреждений ДНК человека (в основном двунитиевых повреждений) из-за высокоэнергетического галактического космического излучения (ГКЛ), предполагается, что НАСА может запустить длительную исследовательскую программу для изучения скорости НСК и способов её увеличения с использованием одноцепочечных антител, таких как ScFv. Цель будет в том, чтобы увеличить время пребывания человека на Луне и Марсе, по крайней мере, в два раза.

Перевод статьи Персиваля Маккормака

Список использованных источников:

1. Ward,J.F.(1998) «Nature of Lesions formed by Ionizing Radiation» In: DNA Damage and Repair(Vol.2)pp.65-84. Eds. Nicoloff.J. and M.Hoekstra. Humana Press, New Jersey.

2. Hefferin,M. and Lombarison,A.(2005) DNA Repair. VolA, pp.639-648.

3. Wa1ker,J.R.,Corpina,R.A. et a1 (2001) » Structure of the Ku Heterodimer Bound to DNA and its Implication for DSB Repair» Nature. Vol.412 pp. 607-614.

4. Hanakahi,L.A., Bartlet-Jones, et a1 (2000) «Binding of Inositol Phosphate to DNA-PK and Simulation of DSB Repair» Cell. Vo1.l02(6) pp. 721-729.

5. Hanakahi,L.A., West,S.C. (2002) «Specific Interaction of IP6 with Human Ku70/80, the DNA-binding Subunit of DNA-PK» Embo J. Vol.21(8) pp. 2038-2044.

6. Ma,Y., Lieber,M.R. (2002) «Binding of Inositol Hexakiphosphate(IP6) to Ku but not to DNA-PK» J.Biol.Chem. Vol.277(13) pp. 10756-10759.

7. Mahajan,K.N. and McElhinny,S.A. et al (2002) “Association of DNA polymerase mu (pol mu) with Ku and ligase IV’ Mol.Cell.Biol. Vol.22(14) pp.5194-5202.

8. Lee,J.W., Blanco,L. et al (2004) “Implication of DNA polymerase lambda in Alignment – based Gap-filling” J.Biol.Chem. Vol.279(1) pp.805-811.

9. Di Leonardo,A., Linke,S.P. (1998) “DNA Damage triggers a Prolonged p53- Dependent G1 Arrest” Genes Dev. Vol.8 pp.2540-2551.

10. Metzger,L. and Iliakis,G. (1991) “ Kinetics of DNA DSB Repair” Int.J.Rad. Biol. Vol.59 pp.1325-1339.

11. Featherstone,C. and Jackson,S.P. (1999) “DNA DSB Repair” Curr.Biol. Vol.9 pp. R759-R761.

12. Collis,S.J.,DeWeese,T.L. et al (2005) “The Life and Death of DNA-PK” Oncogene Vol.24 pp. 949-961.

13. Rogakou,E.P.,Boon,C. et al (1999) “Megabase Cromatin Domains involved in DNA DSBs in vivo” J.Cell Biol. Vol.146 pp. 905-916.

14. Yoo,S., Kimzey,A.and Dynan,W.S. (1999) “Photocross-linking of an Oriented DNA Repair Complex” J.Biol.Chem. Vol.274 pp.20034-20039.

15. Yoo,S. and Dynan,W.S. (1999) “ Geometry of a Complex formed by DSB Repair” Nucleic Acids Res. Vol.27 pp.4679-4686.

16. Mimori,T. and Hardin,J.A. (1986) “ Mechanism of Interaction between Ku protein And DNA” J.Biol.Chem. Vol.261 pp. 10375-10379.

17. Dvir,A., Peterson,S.R. et al (1992) “Ku Autoantigen is the Regulatory Component” Proc.Natl.Acad.Sci. USA Vol. 89 pp. 11920-11924.

18. Gottlieb,T.M. and Jackson,S.P. (1993) “The DNA-dependent Protein Kinase” Cell, Vol.72 pp.131-142.

19. Chan,D.W.,Chen,B.P. et al (2002) “Autophosphorylation of the DNA-dependent Protein Kinase Catalytic Subunit” Genes Dev, Vol.16 pp.2333-2338.

20. Bird,R.E., Hardman,K.D. et al (1988) “Single-chain Antigen-binding Proteins” Science Vol.242, pp.423-426.

21. Woodward,R.L.,Lee,K. et al (2001) “Distinct Roles for Ku protein in DNA Repair” J.Biol.Chem. Vol.276 pp.15423-15433.

22. Mo,X.and Dynan,W.S. (2002) “Subnuclear Localization of Ku protein“ Mol.Cell Biol. Vol.22 pp.8088-8099.